2000年6月，首次涉足话剧舞台，出演中国首部网络题材话剧《WWW.COM》饰夏炎。该剧首轮连演42场，票房突破120%。同年，主演2部央视剧，历史剧《日出东方》饰杨开慧，青春励志剧《其实不想走》饰凌小怡;并与张世、牛莉主演轻喜剧《男人不难嫁》饰阿香，喜剧天分初展露。
2001年9月，出演《十六岁的花季》续集《走过花季》饰王福娣。12月，主演爱情喜剧《一个人不如两个人》，并为角色牺牲剃光头。
2002年6月，出演都市情感剧《亲情树》，饰演成琳。11月，与徐露、周杰、戴军联袂主演都市爱情剧《说出你的爱》，饰演芬妮。
2003年8月，香港爱情舞台剧《我和春天有个约会》上海首演，连演23场，饰演女主角姚小蝶。
2005年8月，英国名剧《偷心》首推话剧中文版，饰演爱丽丝。首轮连演33场，票房达100%。
2006年5月，主演话剧《我的秘密生活》，饰朱丽小姐。8月，何念执导的话剧《跟我的前妻谈恋爱》首演，饰前妻俞晓红。10月，主演话剧《秀才与刽子手》，饰刽子手妻子栀子花，获第17届上海白玉兰戏剧表演艺术奖配角奖、第12届文华奖文华表演奖、第11届佐临话剧艺术奖最佳女配角奖。
2008年11月，与孙兴主演尚敬执导的情景喜剧《家有外星人》，饰外星人妈妈美丽果。
2009年8月，与朱雨辰、白百何合作电视剧《说谎的爱人》，饰演刘宁。10月，与滕华涛首次合作电视剧《瞧这一家子》，饰演张嘉译的妹妹，自私、任性、虚荣又刁蛮的80后刘颖。
2010年起，与英达长期合作主持《夫妻天下》。11月，再次出演《家有外星人2》美丽果。
2011年1月，客串滕华涛执导的电视剧《裸婚时代》，饰演姚笛女上司特雷西，并入主“静家族”主持《我爱每一天》。4月，何念执导的话剧《撒娇女王》全国首演，出演北京故事女主角李莫同时客串上海民政局弄堂阿婆，并客串电影《失恋33天》中的富婆。6月，与郭德纲主演喜剧电影《车在囧途》，饰单亲妈妈、包工头严小莲。高鑫在片中客串其前夫，夫妻完成大银幕首次合作。7月，再次与滕华涛合作电视剧《时尚女编辑》，饰毒舌女编辑李败犬。9月，与林申、阎娜主演电视剧《80后进行时》，饰演张蕴。
2012年，主持湖北卫视《我爱我的祖国》。同年，与辛柏青、姚芊羽合作主演都市家庭轻喜剧《媳妇的美好宣言》，饰演极品小姑子余果;搭档张佳宁、王阳主演都市情感剧《裸婚之后》，饰演黄一琳;与沙溢、胡可、冯嘉怡联袂主演家庭话题剧《孩奴》，饰演唐红。
2013年2月，主持重庆卫视《周末驾到》。4月，参演刘烨、陈宝国等主演史诗巨制《北平无战事》，饰演地下党员崔中石的妻子叶碧玉。7月，首次担任制作人，带领主创下到盲人推拿按摩院、盲童学校观察学习，并与吴军、胡可、刘小峰共同主演话剧《推拿》。
2014年4月，与高鑫婚后首次合作都市家庭情感剧《港媳嫁到》，剧中高鑫和袁咏仪饰夫妻，王一楠和高鑫饰兄妹。4月10日，凭《推拿》获第24届上海白玉兰戏剧表演艺术奖主角提名奖。5月7日，《裸婚之后》首播，收视率稳据收视榜全国第一。
2015年4月，凭借话剧《推拿》获得第18届佐临话剧艺术奖最佳女主角奖。5月，与俞飞鸿、姜武、颜丙燕、戴立忍联袂出演赵晨阳执导的都市情感剧《洋嫁》，在剧中饰演在美国长大的强势女律师田小麦。8月，与杨颖、倪妮合作的爱情喜剧电影《新娘大作战》上映，饰演杨颖的好闺蜜、舞蹈老师小白。
2016年6月，出演迪丽热巴、盛一伦主演的职场暖心喜剧《漂亮的李慧珍》，饰演杂志社资深编辑、贴心美丽女BOSS朱英，既是主编的得力助手，又是同事的知心姐姐;同年，出演电视剧《我们的少年时代》，饰演班小松妈妈。
2017年，参演由张开宙执导的古代家庭剧《知否?知否?应是绿肥红瘦》。
1998年，王一楠与高鑫首次合作拍摄电视剧《丰园餐厅》。同为老乡的二人很快熟悉。王一楠原本将高鑫介绍给自己的好友，但高鑫却喜欢王一楠，还说：“你要是过了三十岁了还没结婚，我娶你!”首次拍吻戏全剧组从制片人到场工都借这个良好的契机撮合高鑫、王一楠在一起。
2000年5月，王一楠在银川拍摄电视剧《草原之夜》坠马，从锁骨到下颌骨粉碎性骨折。刚拍摄完《情深深雨濛濛》的高鑫事业刚起步，推掉所有片约照顾王一楠8个多月直至她基本康复，二人才真正走到一起。此后四年求医问药的漫长过程高鑫不离不弃，随时陪王一楠看病。
2007年7月，王一楠和高鑫在上海登记结婚，同年在上海举办婚礼，2009年在高鑫老家天津举办婚宴。
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